Optogenetyka: jak światło włącza i wyłącza neurony i skąd wzięła się ta metoda

Optogenetyka to technika neurobiologiczna, w której aktywność określonej grupy neuronów reguluje się światłem. Komórki nerwowe stają się światłoczułe, bo wprowadza się do nich gen białka z rodziny opsyn, najczęściej na nośniku wirusowym. Białko wbudowuje się w błonę komórkową i pod wpływem światła pobudza neuron albo go hamuje.

Opieram się na haśle o optogenetyce w polskiej i angielskiej Wikipedii. To opracowania przeglądowe, a nie jedna praca badawcza. Porównałem obie wersje i tam, gdzie się różnią, zaznaczam to w tekście.

Jak to działa

Światłoczułe białka pochodzą z organizmów, które same korzystają ze światła. Według polskiej Wikipedii najczęściej używa się trzech:

• ChR2 (kanałorodopsyna-2) z zielenicy Chlamydomonas reinhardtii - kanał jonowy, najsilniej pobudzany światłem niebieskim,
• VChR1 z zielenicy Volvox carteri - też kanał jonowy, pobudzany światłem zielonym,
• halorodopsyna z archeona Natronomonas pharaonis - pompa jonowa, aktywowana światłem żółtym.

Kanały ChR2 i VChR1 pod wpływem światła przepuszczają kationy. Ich napływ do wnętrza neuronu wywołuje depolaryzację, czyli pobudzenie. Halorodopsyna przenosi do wnętrza komórki aniony chlorkowe, co prowadzi do hiperpolaryzacji błony i hamuje neuron.

1. Wektor: Gen opsyny trafia do mózgu na nośniku wirusowym
2. Promotor: Sekwencja promotorowa ogranicza ekspresję do wybranego typu komórek
3. Opsyna w błonie: Białko wbudowuje się w błonę neuronu
4. Światło: Światło o właściwej długości fali dociera do komórek
5. Reakcja: Neuron zostaje pobudzony albo zahamowany

Źródło: Wikipedia (pl, en): Optogenetyka

Jak dostarcza się gen i światło

Według polskiej Wikipedii najczęstszą i najszybszą metodą jest wstrzyknięcie wektora wirusowego (np. lentiwirusowego) w docelowy region mózgu. Dzięki promotorowi swoistemu dla typu komórek białko powstaje tylko w wybranych neuronach, na przykład w pobudzających neuronach glutaminergicznych. Inna, bardziej czasochłonna droga to linie myszy transgenicznych, które wytwarzają światłoczułe białko w określonych neuronach przez całe życie.

Angielska wersja opisuje wariant z myszami „driver", które wytwarzają enzym Cre. Wektor z genem opsyny między dwoma miejscami lox-P działa wtedy tylko w komórkach z Cre. Nie trzeba przy tym tworzyć nowej linii zwierząt za każdym razem, gdy potrzebna jest nowa opsyna.

Światło trzeba jeszcze doprowadzić do tkanki. W przypadku większości zwierząt głęboko położone obszary mózgu wymagają wprowadzenia światłowodu. Powierzchowne obszary, np. korę mózgu, można oświetlać światłowodami lub diodami LED przymocowanymi do czaszki. Opisano też rozwiązania bezprzewodowe, które dają zwierzętom większą swobodę ruchu. Wyjątkiem jest nicień Caenorhabditis elegans: ma przezroczyste powłoki ciała, więc nie wymaga wprowadzania źródła światła do wnętrza.

Hasło podkreśla precyzję czasową rzędu milisekund. Pozwala ona nadążać za szybkim przetwarzaniem informacji w układzie nerwowym.

Skąd się wzięła metoda

Tu polska i angielska Wikipedia się różnią. Polska podaje, że możliwość sterowania neuronami światłem zasugerował Francis Crick w 1999 roku. Angielska wskazuje rok 1979. Nie rozstrzygam tego i nie podaję daty jako pewnej.

1. Styczeń 2002Zemelman i Miesenböck: światłoczułe neurony ssaków z rodopsyną z muszki owocowej
2. 2003Praca o ChR2 z oocytami żaby: kanałorodopsyna jako narzędzie do pobudzania komórek
3. Sierpień 2005Zespół Deisserotha i Nagela: pierwszy jednoskładnikowy układ optogenetyczny w neuronach
4. Grudzień 2005Gottschalk i Nagel: światłem wywołano wzorce ruchowe u nicienia C. elegans
5. 2007Zespoły Boydena, Deisserotha, Gottschalka i Nagela: optogenetyczne hamowanie neuronów
6. 2010Optogenetyka Metodą Roku w Nature Methods
7. 2021Zespół Botonda Roski: podejście zastosowane u pacjenta z zaburzeniem wzroku

1. Styczeń 2002: Zemelman i Miesenböck: światłoczułe neurony ssaków z rodopsyną z muszki owocowej
2. 2003: Praca o ChR2 z oocytami żaby: kanałorodopsyna jako narzędzie do pobudzania komórek
3. Sierpień 2005: Zespół Deisserotha i Nagela: pierwszy jednoskładnikowy układ optogenetyczny w neuronach
4. Grudzień 2005: Gottschalk i Nagel: światłem wywołano wzorce ruchowe u nicienia C. elegans
5. 2007: Zespoły Boydena, Deisserotha, Gottschalka i Nagela: optogenetyczne hamowanie neuronów
6. 2010: Optogenetyka Metodą Roku w Nature Methods
7. 2021: Zespół Botonda Roski: podejście zastosowane u pacjenta z zaburzeniem wzroku

Pierwsze genetycznie ukierunkowane neurony wrażliwe na światło opisali w styczniu 2002 roku Boris Zemelman i Gero Miesenböck. Użyli rodopsyny z Drosophila melanogaster w hodowli neuronów ssaków. Według polskiej Wikipedii kolejne podobne układy nie upowszechniły się z powodu wysokiego stopnia skomplikowania.

Przełom przyniósł prostszy układ z kanałorodopsyną. Peter Hegemann badał reakcje zielenic na światło, a razem z Georgiem Nagelem pokazał, że jeden gen z Chlamydomonas wytwarza duże fotoprądy w oocytach żaby. W sierpniu 2005 roku laboratorium Karla Deisserotha na Uniwersytecie Stanforda, we współpracy z Nagelem, opublikowało pierwszą demonstrację jednoskładnikowego systemu optogenetycznego w neuronach.

Angielska Wikipedia dodaje, że według samego Zhuo-Hua Pana pierwszą obserwację aktywacji neuronów siatkówki kanałorodopsyną wykonał on w lutym 2004 roku, pięć miesięcy przed Deisserothem. To relacja autora, więc traktuję ją jako jego twierdzenie.

W 2010 roku optogenetykę wybrano Metodą Roku 2010 w czasopiśmie Nature Methods. Angielska Wikipedia podaje też, że w 2026 roku Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny przyznano za optogenetykę Karlowi Deisserothowi, Peterowi Hegemannowi i Georgowi Nagelowi. Tej informacji nie ma w polskim haśle i nie sprawdzałem jej w komunikacie komitetu noblowskiego.

Do czego służy

Hasło opisuje przede wszystkim badania podstawowe, głównie na gryzoniach.

• Strach. Optogenetykę szeroko stosuje się do badania połączeń w ciele migdałowatym i ich roli w powstawaniu strachu. W jednym z opisanych eksperymentów u myszy obserwowano oscylacje 4 Hz między ciałem migdałowatym a korą przedczołową, związane z reakcją zamrożenia. Stymulacja interneuronów światłem wywoływała takie zachowanie.
• Ból. Stymulacja neuronów hamujących w przedniej korze zakrętu obręczy zmniejszała u myszy odruchowe reakcje na ostry ból.
• Uzależnienia. Neurony cholinergiczne jądra półleżącego stanowią mniej niż 1% neuronów tego regionu. Mimo to kontrolują aktywność zakończeń dopaminergicznych. Autorzy hasła sugerują, że mogą być celem terapii uzależnienia od kokainy, ale to hipoteza, nie wynik kliniczny.
• Choroba Parkinsona. Dzięki optogenetyce lepiej poznano połączenia w jądrach podstawy, których zaburzenia wiążą się z tą chorobą.
• Serce. Opisano próby kończenia arytmii światłem. Hasło zaznacza, że metoda jest wciąż na etapie rozwoju.
• Słuch. U głuchych myszy optogenetyczna stymulacja zwoju spiralnego przywróciła aktywność słuchową.
• Wzrok. Angielska Wikipedia podaje, że u pacjenta z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki częściowo przywrócono wzrok. Eksperymentalne leczenie ślepoty wykorzystuje kanałorodopsynę w komórkach zwojowych, pobudzaną wzorcami światła z gogli.

Ograniczenia metody

Angielska Wikipedia wymienia kilka problemów technicznych:

1. Nierówna ekspresja. Nie każda komórka wytwarza opsynę na tym samym poziomie, więc to samo światło działa na neurony różnie.
2. Spadek natężenia światła. Im dalej od źródła, tym słabsze oświetlenie, więc stymulacja w mózgu jest mniej kontrolowana.
3. Kinetyka. Oryginalna ChR2 zamykała się wolniej niż typowe kanały neuronów kory, co prowadziło do przedłużonej depolaryzacji. Impulsy światła aktywują też komórki synchronicznie, inaczej niż naturalne impulsy.
4. Widmo światła. Używane opsyny pozostają wrażliwe na światło niebieskie, a tego samego światła wymaga większość wskaźników genetycznych aktywności komórek. To utrudnia łączenie obu technik.
5. Rozpraszanie. Wąska wiązka może wywołać odpowiedź znacznie szerszą niż sama wiązka, więc neurony mogą zostać pobudzone lub zahamowane niezamierzenie.

Pytania i odpowiedzi

Czym jest optogenetyka?

To technika, w której aktywność wybranych neuronów kontroluje się światłem. Komórki uzyskują światłoczułość dzięki wprowadzeniu genu białka z rodziny opsyn. Białko wbudowuje się w błonę i pobudza lub hamuje neuron.

Jakim światłem steruje się neuronami?

Zależy to od białka. Według polskiej Wikipedii ChR2 najsilniej pobudza światło niebieskie, VChR1 - zielone, a halorodopsynę - żółte.

Czy optogenetyka leczy ludzi?

Hasło opisuje przypadek częściowego przywrócenia wzroku u pacjenta z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Większość zastosowań, np. w sercu czy słuchu, to badania na zwierzętach lub podejścia eksperymentalne.

Dlaczego w badaniach używa się nicienia C. elegans?

Według polskiej Wikipedii ma mało skomplikowany i dobrze poznany układ nerwowy, a jego zachowaniami da się wyraźnie sterować. Przezroczyste ciało pozwala oświetlać neurony bez wprowadzania źródła światła do wnętrza.

Źródła

• Wikipedia (pl) - Optogenetyka
• Wikipedia (en) - Optogenetics

Widzisz błąd albo nieścisłość? Napisz - poprawię i dopiszę datę aktualizacji.